猪圆环病毒研究进展
2016-06-23未知
猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒，是一种重要的病原微生物。PCV具有PCV1和PCV2两种基因型。PCV1无致病性，但广泛存在猪体内及猪源代细胞系,PCV2具有致病性，主要引起猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS），该病是一种新的传染病。1991年，在加拿大首次爆发该病，随后，美国、英国、德国、法国、爱尔兰、捷克、西班牙、中国台湾、荷兰、瑞士、阿根廷、墨西哥、日本、丹麦、意大利、韩国、匈牙利、泰国及中国等国家和地区都有该病的报道[1-4]，该病主要导致多系统病理损伤和进行性消瘦，已给养猪业造成相当严重的经济损失。PCV2病毒除了能引起PMWS外，该病毒还可以造成育肥猪皮炎与肾病综合征[5]、怀孕母猪的繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤。目前，国内外学者正在对该病毒的流行病学特征、致病机理、免疫机理及诊断方法等进行深入的研究[6-8]。
1 猪圆环病毒分类地位与形态
Tischer等（1974）研究发现，在多株连续传代的猪肾细胞—PK15细胞中存在一种类似小RNA病毒的圆形小颗粒病毒，该病毒可以持续感染PK15细胞，但不会引起细胞病变（CPE）, 1982年他证实并命名为猪圆环病毒。
猪圆环病毒在分类地位上属于圆环病毒科，圆环病毒属。圆环病毒科是在国际病毒分类委员会（ICTV）第6次学术报告会上被新命名的一个科，该科下设圆环病毒属。该科病毒的基本特征是病毒粒子无囊膜、基因组为单股、环状及闭合DNA。该科动物病毒主要有鸡贫血病毒、鹦鹉喙羽病病毒（BFDV）[9]、猪圆环病毒、鸽子的圆环病毒及鹅的圆环病毒等。圆环病毒属成员的共同特征是：（1）具有潜在的环柄序列基元，该基元与滚环复制的启动有关；（2）具有2个主要的开放阅读框，分别位于病毒正链与其互补链之上，编码病毒复制相关蛋白（Rep）与病毒衣壳蛋白（Cap）；（3）同属成员复制相关蛋白的氨基酸同源性较高，在41.2%-58.2%之间；（4）公认的基因间隔区存在正向或反向重复序列。
猪圆环病毒（PCV）是圆环病毒属的代表种，它是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状的单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前发现的最小的动物病毒。同属的病毒还包括鹦鹉喙羽病病毒、鸽圆环病毒及鹅圆环病毒。后来研究人员根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差异，将PCV被划分成了无致病性（或PK15源性）的PCV1和有致病性（PMWS源性）的PCV2两个基因型[4]。
2 PCV的分子生物学特征
PCV2的基因组全长为1767bp或1768bp。PCV1的基因组全长为1759bp, PCV序列中都含有序列类似为5’-TAGTATTAC-3’的1个茎-环结构（stem-loop structure），这种茎-环结构可能就是病毒滚环复制的起点。PCV2和PCV1的核苷酸的同源性低于80%，由基因序列推出的氨基酸的序列同源性小于76%；PCV2分离株间核苷酸的同源性大于94%，而PCV1分离株间核苷酸的同源性大于99%。PCV1含有7个编码大于5 kDa产物的开放阅读框（ORFs），PCV2含有11个编码产物在2kDa-36kDa的ORFs或6个ORFs。位于正链上的最大开放读码框（ORF1）编码病毒的复制相关蛋白（Rep），而位于负链上的ORF2编码病毒的结构蛋白（Cap）。ORF1变异较小，而ORF2变异较大。
3 PCV2诊断技术
PCV2可引起断奶仔猪PMWS，它是一种新的病毒性传染病。PMWS的发生和流行已经给世界的养猪业造成了巨大的经济损失。自1996年以来，该病的发生呈世界性趋势。所以，作好该病的诊断及预防显得尤为重要。有学者建议针对PMWS的诊断应具备以下3项原则：临床症状，组织病理学变化和检测抗原。根据发病的临床症状及流行病学特点，可以初步确诊为PCV2 的感染。但是要做到对猪PCV2感染的确切诊断还需要借助于实验室的诊断技术，主要包括病理组织学变化、病毒的分离和鉴定、抗原的检测及血清学诊断技术。
3.1 病毒抗体的检测技术
间接免疫荧光（IFA）是检测病毒抗体的常用的方法，PCV2病毒抗体的检测也可以用免疫荧光进行。Allan等（1998）利用间接免疫荧光来检测PCV2[10]。也就是将组织病料以盖玻片在PK-15细胞培养，丙酮固定，用兔抗PCV2高免血清与细胞培养物中的PCV2反应，可对PCV2进行检测和分型。我国的芦银华等（2002）也用免疫荧光来检测PCV2病毒[11]。
ELISA方法是一种灵敏、快速适合于大规模检测的诊断方法。常用的诊断PCV2病毒的ELISA方法包括竞争ELISA、间接ELISA和抗原捕获ELISA等。
Walker等（2001）首次利用PCV1和PCV2特异性单克隆抗体建立了竞争ELISA（c-ELISA）方法来检测PCV2的抗体。用细胞培养的病毒（PCV2）作为抗原，用PCV2特异性单克隆抗体作为竞争试剂成功地建立了竞争ELISA方法，并利用该方法和间接免疫荧光相比较：对来自英国、加拿大和法国的484份感染PCV2的猪血清的检测结果表明，竞争ELISA方法的检出率为99.58%，而间接免疫荧光的检出率仅为97.14%，说明该方法比免疫荧光方法更敏感，可用于PCV2抗体的大规模监测。
Nawagitgul等（2002）建立了简单、可靠的间接ELISA方法来检测PCV2感染中PCV2抗体[12]。他建立了2种改良的间接ELISA方法：其一是，基于细胞培养的PCV2病毒来包被板子；其二是，基于重组的主要核衣壳蛋白（ORF2）来包被板子。为了评估这2种检测方法，783份小猪和育成猪血清被用来检测并和间接免疫荧光相比，结果表明这2种方法敏感、特异，准确率都达90%以上。应用这些方法来检测病毒抗体，不但可以更好的了解宿主对PCV2的免疫反应，而且有利于更好的预防和控制PCV2在猪群中的流行。
McNeilly等（2002）建立了抗原捕获ELISA检测PCV2病毒从而诊断PMWS，但是该方法还处于进一步的研究中。
3.2 病毒抗原的检测技术
Choi等（1999）用地高辛标记的探针做原位杂交检测PCV病毒[13]。随后，他又用原位杂交技术研究PCV2病毒和猪细小病毒在猪体内的病毒分布情况[14-16]。
Kim等（2001）建立了可以区分PCV1和PCV2的原位杂交方法。他用非放射性的地高辛标记探针：针对PCV1（ORF1）特异的DNA片段349bp和针对PCV2（ORF2）的特异的DNA片段481bp。借助于PCR技术获得这2个目的片段，进行地高辛标记，然后用于原位杂交，从福尔马林固定，石蜡包埋的组织中检测病毒的DNA。检测结果发现，在淋巴结和脾脏处的杂交信号最强，阳性信号表现为从黑棕色到黑色变化。主要位置在组织细胞的胞浆，偶尔也在组织细胞的胞核中发现阳性信号。该原位杂交方法能用来从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中检测和区分猪圆环病毒感染。原位杂交和免疫组化相比，二者均可被用来作为PCV2病毒诊断的工具，但原位杂交比免疫组化更灵敏。
PCR方法是一种快速、简便和特异的诊断方法。随后又出现了多重PCR，巢式PCR，多重巢式PCR等检测猪圆环病毒的诊断方法。
吕艳丽等（2002）根据PCV2的基因序列设计1对特异的PCR引物，进行PCR检测，建立了特异的PCR诊断方法。该方法可以检测细胞中和组织中的病毒核酸[17]。王忠田等（2002）利用PCR技术对发病的规模化猪场进行了PCV2感染的调查，同时利用该方法研究了PCV2病毒在自然感染猪体内的分布情况[18]。结果发现，6例自然感染PMWS的患猪的淋巴结、脾和肾中均检测到PCV2 DNA（6/6），在心脏中仅检测到1（1/6）份。说明PCV2病毒主要分布于淋巴结、脾脏和肾脏中，心脏中最少。
多重PCR（multiplex PCR）是一种特殊的PCR技术，它可以简单、方便的同时检测两种或两种以上的病毒DNA。即在同一反应中加入多对引物，扩增多个目的基因片段。该方法方便、快捷，已广泛用于医学临床上应用，给疾病的快速诊断带来了方便。
Larochelle等（1999）建立了多重PCR（multiplex PCR）方法来检测和区分PCV1和PCV2病毒。他应用多重PCR方法对1997-1998年期间的42份病料做了检测，结果有40份感染了PCV2，1份检测出PCV1感染，1份检测出二者混合感染。Ouardani等（2000）根据已发表的PCV2和PCV1基因序列设计2套引物，1套中的1对引物针对PCV1和PCV2的ORF2基因序列，对这2个基因型均可扩出488bp的目的条带，并且1对引物对PCV1的ORF1基因能扩增出375bp的基因片段，而对PCV2的ORF1不能扩增；另一套中的一对引物针对PCV1和PCV2的ORF1基因序列，对这2个基因型均可扩增出646bp的目的条带，另1对引物只对PCV2的ORF2基因能扩增出425bp的目的条带，而对PCV1基因的ORF2基因不能扩出，从而很好地区分PCV1和PCV2的感染。我国芦银华等（2002）也建立了一种简单的复合PCR(multiplex PCR)法。他对2株PK15细胞进行PCV检测，结果2株PK15细胞培养物均可扩出PCV1的基因片段，其中1株还扩增出PCV2的DNA片段，由此可见，利用所建立的复合PCR可对PCV病毒进行检测和分型。
Kim等（2000）建立了检测和区分PCV1和PCV2的多重巢式PCR方法[19]。他用该方法从猪精液中检测PCV。60份精液样品当中，用传统的多重PCR仅检测出8份（30%）PCV阳性；而用多重巢式PCR检测出30份（50%）阳性。30份阳性样品中，有1份是仅PCV1阳性；有18份仅PCV2阳性；有20份是PCV1和PCV2双阳性。结果表明，该多重巢式PCR方法比传统的病毒分离方法更敏感、快速，对于从公猪精液中检测和区分PCV1和PCV2，不失为一种好方法。
Fenaux 等 (2000) 根据已有的PCV毒株的基因序列，建立了通用的PCR-限制性长度多态性分析方法，该PCR-RFLP方法不但可以用作PCV2的致病性研究，而且可以用来检测来自不同地理区域的PCV2的感染情况。Hamel等（2000）为检测猪圆环病毒，借助于RFLP建立了可以分型的PCR诊断方法。该方法很容易检测PCV1和PCV2。他根据已发表的所有PCV基因组的保守序列设计引物，对PCV1和PCV2毒株的基因均能扩增出438bp的基因片段，这些片段经限制性片段长度多态性分析，就较容易鉴定和区分PCV2毒株的基因型。
近年来，尽管国内外学者在猪圆环病毒的研究方面取得了不小成就，但到目前为止，仍没有找到有效的方法和措施来控制猪圆环病毒对养猪业的危害，本文对猪圆环病毒的分类地位,分子生物学特征,检测技术等方面进行了综述，以便能为有效防控猪圆环病毒提供科学的参考依据。
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（作者：黄建明2,李华周2,孔留五1.2,于淼1,张桂红）
（来源：防疫一线）