应用荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒
2017-10-11《动物防疫一线》2017年第4期
应用荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒
张险朋1*，卢沛炯2*，郑腾3*，万庆文2*，黄炳炽1*
（1.广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086 ；2.广东省东莞市万江农业技术服务中心，广东东莞 523050；3. 福建出入境检验检疫局/福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建福州 3500051）
摘要：为了验证荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒的可行性，采用荧光免疫层析法分别对标准抗原和临床样品进行检测，评价该方法的特异性、敏感性、稳定性和方法的适用性。结果为H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出H7N9、H7N2亚型禽流感抗原阳性，对其他抗原检测结果为阴性；能检出H7N9、H7N2亚型禽流感病毒抗原（血凝效价1:512）1000倍的稀释度；检测10次H7N9亚型禽流感抗原的变异系数为1.12%，差异不显著；检测临床100份样品结果均为阴性。结果表明，应用荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒操作简便、试验时间短和不受人为因素干扰，适合市场、养殖场大规模的监测或检疫。
关键词：荧光免疫层析法 H7亚型禽流感病毒 检测 验证
禽流感是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的高度接触性传染病。AIV属于正黏病毒科甲型流感病毒属，病毒基因组由8个单股负链RNA组成，共编码12-13种蛋白，根据表面蛋白HA和NA，已知可分为16种HA亚型和9种NA亚型血清型[1]。根据AIV对鸡的致病性不同，可以将AIV分为高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV）[2]。目前，已有禽流感病毒H5N1、H5N2、H5N6、H9N2、H7N7、H10N7和H10N8等均有感染人的报道[3]。2013年3年31日首先在中国上海和安徽发现了3例人感染H7N9禽流感病例[4]，截止2017年3月8日，根据世界动物卫生组织（OIE）、联合国粮农组织（FAO）和有关权威机构的报告，人感染H7N9亚型禽流感累计病例数达1292例[5]。由于H7N9亚型禽流感对人的高死亡率，对公共卫生安全和社会稳定造成较大的影响，对于该病防控，进行监测和早期诊断显得尤为重要。近几年来，荧光免疫层析技术在胶体金层析技术的基础上得到了较大的改进,已经广泛应用于动物疫病监测和诊断，为了验证荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒可行性，对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证，并对采集的临床样品进行了检测，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 临床样品
采自三鸟批发市场，共100份，其中鸡泄殖腔拭子50份，鸡喉拭子50份，用PBS液-20℃保存。
1.1 试剂和仪器
H7N9亚型禽流感抗原、H7N2亚型禽流感抗原、H5N1亚型禽流感抗原、H9N2亚型禽流感抗原、新城疫抗原为哈尔滨维科生物技术开发公司，批号分别为：2014002、2014001、2015028、20150403、20150403；H5N2亚型禽流感抗原由华南生物有限公司提供，批号：20140520；H6N6亚型禽流感抗原由英国国家实验室，批号：06606-070306；H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条由深圳市易瑞生物技术有限公司提供，批号：20160104；荧光检测仪由深圳市易瑞生物技术有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 特异性试验方法
用2mL PBS分别溶解H7N9亚型禽流感抗原、H7N2亚型禽流感抗原、H5N1亚型禽流感抗原、H5N2亚型禽流感抗原、H6N6亚型禽流感抗原、H9N2亚型禽流感抗原、新城疫抗原，分别用PBS液1:10稀释，用移液器吸75uL加入H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上，15min后，用荧光检测仪读取数值，结果判定以 cut off值大于等于80判为阳性，小于80判为阴性。
1.2.2 敏感性试验
分别用PBS液10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍稀释H7N9亚型禽流感抗原和H7N2亚型禽流感抗原，用移液器吸75uL加入H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上，15min后，用荧光检测仪读取数值，结果判定以 cut off值大于等于80判为阳性，小于80判为阴性。
1.2.3 变异系数
用PBS液1:1000稀释H7N9亚型禽流感抗原，用移液器吸75uL加入H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上，15min后，用荧光检测仪读取数值，结果判定以 cut off值大于等于80判为阳性，小于80判为阴性。
1.2.4 临床样品检测
用移液器吸75ul临床样品加入H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上，15min后，用荧光检测仪读取数值，结果判定以 cut off值大于等于80判为阳性，小于80判为阴性。
2 结果
2.1 特异性试验结果
采用H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测不同毒株抗原，结果为H7N9亚型禽流感抗原，H7N2亚型禽流感抗原阳性；H5N1亚型禽流感抗原、H5N2亚型禽流感抗原、H6N6亚型禽流感抗原、H9N2亚型禽流感抗原、新城疫抗原均为阴性，详细结果表1。结果表明，H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出H7N9、H7N2亚型流感病毒，而对其他毒株检测结果均为阴性，H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条特异性强。
表1 不同亚型禽流感抗原和新城疫抗原检测结果
2.2 敏感性结果
H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能检测出到1：1000倍稀释的H7N9亚型禽流感抗原阳性，1：10000倍稀释以后的检测结果为阴性；能检测到1：1000倍稀释的H7N2亚型禽流感抗原检测结果为阳性，1：1000倍稀释以后的检测结果为阴性，详细结果见表2。结果表明，H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出H7N9、H7N2亚型禽流感抗原（血凝效价1:512）1000倍的稀释度。
表2 不同稀释度H7N9、H7N2亚型禽流感抗原检测结果
2.3 变异系数检测结果
采用H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测10次1:1000稀释的H7N9亚型禽流感抗原，结果均为阳性，详细结果表3，变异系数为1.12%，差异不显著，结果表明H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测结果稳定。
表3 H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条稳定性检测结果
2.4 临床样品的检测结果
采用H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测临床样品共100份，其中鸡泄殖腔拭子50份，鸡喉拭子50份，结果均为阴性，详细结果见表4。
表4 部分临床样品H7亚型流感病毒检测结果
3 讨论
H7N9亚型禽流感是一种新型禽流感，传染源主要是带毒的家禽或家禽感染后通过粪便、唾液和鼻腔分泌物和粪便等排出的病毒，人主要是通过接触染毒家禽或者被其污染的物品或环境引起感染[6]。根据研究表明，活禽暴露是人感染H7N9流感的关键风险因素，活禽交易市场是传染源之所在，从对市场调查的结果来看，市场污染严重[7]。为了加强在源头上的控制，做好活禽交易市场的检疫，及时发现H7N9流感病毒, 建立H7N9流感病毒的快速检测方法显得尤为重要。传统的H7N9流感病毒检测方法，包括病毒分离鉴定，荧光RT-PCR方法、普通RT-PCR方法或者是HA和NA扩增后的测序。这些方法存在费时费力或对实验室生物安全等级要求高的缺点。荧光免疫层析法使用荧光微球标记，捕获被测样本中的H7亚型流感病毒，此次试验结果表明，应用该方法检测H7亚型流感病毒特异性强，可以检测到1000倍稀释的H7N9亚型禽流感抗原，稳定性好，适合大规模样品的检测。目前，我国流行的H7亚型流感的主要为H7N9亚型流感，采用荧光免疫层析法检出H7亚型流感阳性的样品需再进一步进行荧光RT-PCR检测或病毒分离鉴定，确定H7亚型流感的型别。
荧光免疫层析法是在胶体金免疫层析技术上的改进，改进后的荧光免疫层析法与胶体金免疫层析技术相比更具有优势，其示踪标记物采用更灵敏的荧光纳米微球，根据试验的结果显示荧光免疫层析法比胶体金灵敏度要提高100-1000倍[8]，并且荧光免疫层析法采用手持式荧光仪读取数值，受人为因素影响小，整个试验过程只需20min。荧光免疫层析法操作简便、试验时间短、不受人为因素影响适合活禽交易市场和养殖场H7亚禽流感病毒初筛，为防控H7N9流感提供了一个新技术。
参考文献：
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福建省科技计划重点项目（项目编号：2014I0010）