食品中单增李斯特菌荧光PCR检测方法的建立
2017-10-18《动物防疫一线》2017年第5期
食品中单增李斯特菌荧光PCR检测方法的建立
刘芳，徐振娜，洪伟彬，谢海燕
（广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞523086）
摘要：本研究以单增李斯特菌的hlyA基因为靶序列，针对该序列保守区，设计一对特异性引物和探针。通过反应体系和反应程序的优化，建立起单增李斯特菌荧光PCR检测方法，并以单增李斯特菌和9种相关细菌评估该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果表明该方法特异性和重复性好，具有较好的灵敏度，最低可检测到5 cfu/mL。临床样品检测中，该方法与国标法结果一致，说明研究建立的单增李斯特菌荧光PCR方法是快速鉴定单增李斯特菌的有效方法，具有较大的应用和推广价值。
关键词：单增李斯特菌 荧光PCR 检测方法
前言
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种人畜共患食源性致病菌，被WHO列为4种主要的食源性病原菌之一[1]，对妊娠期妇女、新生儿及免疫功能低下的病人健康造成严重威胁，临床表现为脑膜炎、败血症及孕妇流产、胃肠炎等[2]。据研究调查，猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、冷菜和奶制品均有检出单增李斯特菌的报道，场点涉及大中型超市、批发市场生鲜专卖、饭店、蛋糕店和屠宰场等[3-5]。
为了建立一种敏感、准确可靠、简便的快速检测方法，本研究建立了单增李斯特菌荧光PCR检测方法，适用于大批量的样本检测和突发疫情的诊断，具有较大的公共安全意义。
1 材料与方法
1.1 试剂与耗材
DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit为美国OMEGA公司产品，real time PCR试剂为TaKaRa产品。
1.2 主要仪器
7500 Real Time PCR System为美国Applied Biosystems公司产品；NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer 紫外分光光度计为美国NanoDrop Technologies 公司；Sigma 3-18K小型高速冰冻台式离心机为德国Sartorius公司产品。
1.3 菌种
单增李斯特菌（CICC21633）、大肠杆菌O157:H7（CICC21530）、沙门氏菌（CICC21513）、志贺氏肠杆菌（CICC21534）标准菌株从中国工业微生物菌种保藏中心购买；致病性链球菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌和普通变形杆菌等菌株由珠海出入境检验检疫局动物检验检疫实验室保存。
1.4 引物、探针的设计与合成
根据GenBank中公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列，利用生物学软件Clustal X比对后在高度保守区域用Primer Express 2.0设计1套荧光PCR引物、探针，由上海辉睿生物科技有限公司合成。
表1单增李斯特菌引物和探针
1.5 模板DNA的制备
采用水煮裂解法: 菌种在营养琼脂纯化分离后，挑取单个菌落接种于营养肉汤，37℃振荡过夜培养，参照国标法(GB/T4789.2－2003) 对菌株进行平板计数，均配制成108cfu/mL浓度的菌液。取1mL于1.5mL EP管中，12000r/min离心5min，弃上清，沉淀用灭菌ddH2O洗涤2次，12000r/min离心5min，弃上清后加入100μL灭菌ddH2O，漩涡混匀，封口膜封口，水浴煮沸10min，置-20℃10min，取出溶解，漩涡混合器震荡破碎细菌释放核酸，12000r/min离心5min，取上清作为检测模板，-20℃保存备用。
1.6反应体系和反应程序的优化、建立
将单增李斯特菌增菌培养后，提取DNA为模板，进行荧光PCR扩增。反应体系25μL：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，上下游引物各0.8-1.2μL(10μmol/L)，探针0.8-1.2μL(10μmol/L)，DNA模版4-7μL，补水至25μL。反应程序：94℃3min；94℃15s，50-58℃40s（收集荧光信号），25、30、35、40、45、50个循环进行优化。
1.7特异性试验
将单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏肠杆菌、致病性链球菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌和普通变形杆菌等菌株增菌培养后的菌液为模板，使用1.6建立中的反应体系和条件进行荧光PCR扩增，验证所建立的荧光PCR方法的特异性。
1.8 敏感性试验
取已配制成5×109 cfu /mL浓度的单增李斯特菌的菌液1mL，用水煮裂解法提取DNA 作为模板，进行10倍比梯度稀释。同样使用1.6中建立的反应体系和条件进行荧光PCR扩增，验证所建立的荧光PCR方法的敏感性。
1.9 重复性试验
使用1.6中建立的反应体系和条件对单增李斯特菌的阳性模板分别在第1d、第2d、第3d进行重复检测，验证该方法的重复性。
1.10 临床样品检测
从东莞市某农批市场采集60份冻肉样品，其中鸡肉21份、猪肉18份、鸭肉12份、牛肉3份、羊肉6份。用建立的荧光PCR方法进行单增李斯特菌检测。同时用国标法（GB/T 4789.30-2010）进行验证。
2 结果与分析
2.1 反应体系的优化和建立
最终建立的反应体系为：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，上下游引物各1.0μL（10μmol/L），探针1.0μL（10μmol/L），DNA模版5.0μL，补水至25μL。反应程序：94℃3min；94℃15s，55℃40s（收集荧光信号），40个循环。
建立的实时荧光定量PCR反应体系检测单增李斯特菌，结果见图1。通过实验建立的PCR反应体系优化结果荧光强度最强，ct值最低，表明建立的反应体系为单增李斯特菌荧光定量PCR方法最佳反应体系。
图1单增李斯特菌荧光PCR反应体系优化后的检测结果
2.2 特异性试验
对抽提的10种细菌的基因组DNA，利用2.1建立的体系进行检测，结果见图2。由图2可知，建立的检测方法仅对单增李斯特菌检测为阳性，其它9株菌株均为阴性，说明该方法具有较好的特异性。
图2单增李斯特菌荧光PCR特异性试验结果
2.3灵敏性试验
将浓度约为5×109cfu/mL的单增李斯特菌用水煮裂解法提取DNA作为模板，进行10倍梯度稀释为5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5 cfu /mL的菌液各1mL，同样使用2.1反应体系和条件进行荧光PCR扩增，结果见图3，由图3可知，单增李斯特菌目标菌液稀释至5cfu/mL时仍能检出，表明该方法对单增李斯特菌的检测灵敏度约为5cfu/mL。
图3单增李斯特菌荧光PCR灵敏性试验结果
注：1：5×106 cfu/mL；2：5×105 cfu/mL；3：5×104 cfu/mL ；
4：5×103cfu/m；5：5×102cfu/m；6：5×101cfu/m；7：5cfu/mL
2.5 重复性试验
单增李斯特菌的阳性模板分别在第1d、第2d、第3d进行重复检测，结果均一致，说明该方法重复性好。
2.6 临床样品检测
建立的荧光PCR方法对60份冻肉样品进行单增李斯特菌检测，结果为1份样品阳性，阳性率1.67%。国标法结果与荧光PCR方法一致，符合率100%（见表2）。说明该方法准确可靠，可以广泛应用于临床样品检测。
表2 荧光PCR法和国标法检测结果对比
3 讨论
目前单增李斯特菌的检测方法有传统的检测方法以及基于PCR技术、免疫学方法和生物传感器的快速检测方法[6]。传统方法经过增菌富集、分离、生化试验、溶血等实验，确定疑似菌后再进行血清学分型，这类方法过程复杂、检测周期长，不利于大批量和紧急样品的监测[7]。近年来报道显示，实时荧光定量PCR技术具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点，已广泛用于分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等诸多研究领域，是快速检测的现代方法之一[8，9]。
荧光定量PCR技术中，靶基因的选择直接决定了检测方法的真实性和可靠性。编码溶血素的hlyA基因，是被应用最多的靶基因，相关研究已证明其种属特异性[10]，因此，本研究选择该基因作为建立荧光定量PCR方法的靶基因。
本研究通过反复比对，在hlyA基因高度保守区域设计引物和探针，结果具有高度的特异性，除单增李斯特菌外，其余9株其他细菌均为阴性。优化得到了最佳反应体系和反应程序，大大提高了方法的灵敏度，最低可检测到5cfu/mL。灵敏度略高于马晓燕等[11]建立的荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌（12cfu/mL）和徐得顺等[12]建立的食品中单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR快速检测方法（19cfu/mL）。经过连续3天重复使用建立的单增李斯特菌荧光PCR方法检测阳性模板，结果一致，说明该方法重复性好。在临床样品检测中，该方法与国标法结果一致，说明研究建立的荧光PCR方法是快速鉴定单增李斯特菌的有效方法，具有较大的应用和推广价值。
参考文献：
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