猪圆环病毒病诊断技术研究进展
2016-01-28普莱柯生物
猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2) 是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA 病毒，病毒粒子直径平均为17 nm，是目前发现的最小动物病毒。PCV2感染后会引起仔猪先天性震颤（CT）、断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾衰综合症（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）以及妊娠母猪的繁殖障碍等。我国目前圆环病毒在猪群普遍感染，该病不但会引起猪群发病，而且会引起严重的免疫抑制，造成混合感染和引发疫苗的免疫失败，给我国养猪业带来巨大的经济损失。为此，笔者对近年来圆环病毒病的最新临床和实验室诊断技术进行了收集整理，以供同行参考。
1.临床诊断技术
许多疾病与PCV2感染有关，且在不同年龄阶段表现的临床症状也不尽相同。CT主要感染刚出生的小猪，母猪怀孕期间无任何异常表现，仔猪出生或几小时后出现震颤，共济失调。PMWS主要感染断奶后5-10周龄的仔猪，临床表现为精神不振、食欲减退、皮肤苍白、逐渐消瘦、被毛粗乱、咳嗽、喘气，个别出现腹泻等症状。PNDS主要发生在育肥阶段猪只，且在夏季天气炎热季节多发，发病初期背部、耳部和后躯皮肤表面出现圆形或不规则型红斑或丘疹，突出于皮肤表面，疑似蚊虫叮咬，但猪只不表现蹭痒现象。接着红斑中间开始发黑，并逐渐扩散，后期完全变成黑色结痂。发病猪一般体温正常，但逐渐消瘦，抵抗力下降。PRDC通常也发生于育肥阶段，病猪常出现呼吸道症状，表现为间断性咳嗽、腹式呼吸、皮肤苍白、毛粗糙、生长减慢、猪群整体度变差等。此阶段发病容易与伪狂犬、支原体病相混淆。PCV2感染还与猪繁殖障碍有关，引起怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎和弱仔等。
2.病理剖检诊断
猪感染PCV2 后，最显著的剖检病变是全身淋巴结肿大，特别是腹股沟淋巴结、和肠系膜淋巴结肿大2-5 倍。肺部有散在隆起的橡皮状硬块，严重病例肺泡出血，在心叶和尖叶有暗红色斑块。PNDS常引起育成猪大肠出现较深的溃疡灶，肌肉色淡；淋巴结灰白色肿大；脾脏肿大、梗死、质地坚硬；肾脏的特征更明显，出现苍白、肿大，表面出现白色坏死斑块，肾切面肾盂和肾髓质弥散性出血，肾上腺切面可见坏死灶。
3.实验室诊断技术
3.1 病毒分离鉴定
该方法主要是将采集的病死猪组织（主要采集肺脏、淋巴结等）进行研磨制成1∶5（病料与PBS 液体积比）的悬液，在-20 ℃反复冻融3次，12 000 r/min离心15 min，取上清液过220nm 滤器除菌，然后接种已长成单层且无PCV污染的PK-15 细胞，37℃ 吸附1h，然后加入2% 胎牛血清的MEM细胞维持液，37 ℃培养24 h。倒掉细胞培养液，用300 mmol/L D- 氨基葡萄糖，用pH为7.4 的10 mmol/L 无菌PBS 洗涤2次，然后加2%胎牛血清的DMEM细胞维持液，37℃继续孵育48-72 h，在细胞进入对数生长期时进行传代培养，当连续盲传3代后进行PCV2 抗原或核酸的检测加以鉴定。本方法费时费力，不适于疾病的快速诊断。
3.2 免疫学方法
3.2.1 间接免疫荧光
间接免疫荧光（IFA)是将荧光素，如异硫氰酸荧光素（FITC)或罗丹明与某些特异性抗体以共价键结合，但不影响该抗体的免疫特性；然后用此荧光素标记的抗体对标本染色，如果标本中有相应的抗原，则荧光标记抗体与抗原结合形成抗原－抗体复合物，在紫外光或激光的照射下，复合物中的荧光素发出荧光，借助荧光显微镜就能观察到该抗原的定位情况。芦银华等用PK-15细胞增殖猪PCV2制备抗原，建立了检测PCV 抗体的间接免疫荧光试验，采用该方法对64份血清样品的检测中，38份呈现抗体阳性。IFA方法不仅可以用于检测抗体，而且可以用已知PCV特异性抗体检测抗原，主要用于PCV的分离鉴定及猪源细胞PCV污染情况的普查。
3.2.2 免疫组织化学法
免疫组织化学技术（IHC）是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质( 抗原/抗体)在组织细胞内存在部位的一门新技术，即预先将抗体与酶连接，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光学显微镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。唐宁等将猪圆环病毒2型BF株经滴鼻接种28日龄健康普通仔猪，于接种后不同时间剖杀，采集相关的器官组织制备组织切片，使用免疫组化方法检测病毒在猪体内的分布。McNeilly等用IHC方法对患PMWS 猪的淋巴组织进行了检测, 结果发现淋巴组织( 包括骨髓) 中的单核巨噬细胞和组织细胞中PCV-2抗原表现为强阳性, 病毒主要存在于细胞浆中。
3.2.3 免疫过氧化物酶单层试验
免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）是将生长有PCV 病毒的PK-15 细胞在96 孔板上长成单层后，加入10倍稀释的待检猪血清，作用一定时间后吸干洗涤，再加入HRP标记的抗猪IgG抗体，37 ℃ 孵育30min，吸干洗涤后加入底物溶液显色，然后终止反应。刘长明等在优化此检测方法的基础上，研制出一种新的IPMA抗体检测试剂盒，该试剂盒用于猪血清中PCV-2抗体检测，具有特异、敏感、操作简便、实用性强等特点。黄立平等用 PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法，用该方法和免疫过氧化物酶单层细胞试验同时对353份试验猪血清样品进行平行检测，结果两种方法的符合率为96%。
3.2.4 酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附方法（ELISA）是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或酶标仪测定结果的一种方法。本法因特异性高，敏感性强，一次可检测大批样品，检测速度快等优点，是目前应用最多、发展最快，试剂盒应用最广的一种检测方法。张志慧等采用国产阻断ELISA试剂盒对PCV2疫苗免疫猪血清抗体检测表明，疫苗免疫21d后抗体阳性率达50 %，免疫28d抗体阳性率达100%，对PCV2人工感染猪血清抗体检测显示，病毒接种后28d抗体阳性率为30%，第42d阳性率为100%。
3.2.5 免疫胶体金检测技术
胶体金是氯金酸的水溶胶，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素、酶之后，在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。与其他诊断方法比较，胶体金快速诊断技术具有快捷迅速、安全简便、成本低廉、所需试剂和样本量少等优点。王贵华等应用胶体金免疫层析技术，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，在玻璃纤维膜上包被胶体金标记PCV－2抗原( cap蛋白)，在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被PCV－2 抗原(cap蛋白)和PCV－2单抗，制成猪圆环病毒2 型抗体免疫金标检测试纸条。该试纸条与猪圆环2 型抗体酶联免疫检测试剂盒对比，符合率为94.7%，整个实验过程只需15 min。张文通等对SPA蛋白进行胶体金标记，并喷涂于玻璃纤维上制备金标垫，分别以重组PCV2 ORF2 蛋白和猪IgG 作为检测线和质控线，制作PCV2抗体检测胶体金免疫层析试纸条。检测结果表明，试纸条操作简单，肉眼于10 min 内可以判定结果，对PCV2 免疫血清具有高度特异性，与猪其它病毒免疫血清无交叉反应，检测灵敏度与ELISA相近。
3.3 分子生物学检测技术
3.3.1 PCR诊断技术
聚合酶链反应（PCR）是一种快速、简便、特异的诊断方法，可直接检测病毒核酸，在兽医临床检测病原中广泛应用。经过多年研究，已建立了多种形式的PCR方法，主要包括常规PCR、套式PCR、荧光定量PCR及PCR 限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)等方法。
3.3.1.1 常规PCR
常规PCR 是参照Genbank 已发表的猪圆环病毒2型的基因序列, 设计一对PCV- 2特异引物, 如果能从患病猪的病料中扩增PCV-2特异的基因组片段, 就可以证明存在PCV- 2的感染。张国威等根据根据PCV－2的ORF1 基因的保守序列设计了1对引物，建立了PCV－2 的PCR 检测方法，并进行了敏感性、特异性检测，结果表明敏感性和特异性好。然后又用该方法对临床样品进行检测，均能获得预期长度的DNA条带。
3.3.1.2 套式PCR
套式PCR克服了由于组织病料或细胞中的PCV2模板DNA含量太少，而不能检测到PCV2基
因组存在的特点。方法是设计两套引物，先用第1套引物进行PCR，然后取少量PCR 产物作为模板，用第2套引物即套式引物再进行PCR。Kim J等建立了套式PCR 检测方法，在和常规PCR 方法和原位杂交法的比较中，37 份阳性样品用套式PCR 和原位杂交均能检验出来阳性的结果，常规PCR 方法只检测出26 份，表明套式PCR 对于PCV2具有更高的敏感性。
3.3.1.3 荧光定量PCR
荧光定量PCR（FQ-PCR）技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。曹伟伟等在PCV-2的ORF-2核苷酸序列的保守区域，设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物，建立了检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法，并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价；用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测，结果显示该法具有良好的特异性和敏感性，所建立的taqMan实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。
3.3.1.4 PCR 限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）
疾这种方法是指在生物进化过程中，DNA 碱基序列发生插入、缺失或者突变，从而改变了限制性核酸内切酶的识别位点， 是以PCR 快速有效的扩增微量的DNA，利用限制性酶进行多态性分析的一种方法。Fenaux 等利用PCR-RFLP 对PCV1 和PCV2 进行检测和定型，利用仅在PCV2 上有的限制性酶切位点Nco I 来鉴定PCV1 和PCV2。PCV2 的PCR 产物被切成2个片段，而因PCV1上无NcoI 的位点不能被NcoI 切割。经电泳分析，PCV1的酶切片段仍是243 bp，而PCV2 的酶切片段是168 bp 和75 bp。由于PCR-RFLP方法充分考虑了引物序列在不同毒株间的保守性和酶切位点的特异性。因此，该方法可对不同地区来源的毒株进行检测分型，对不同地区PCV 的分子流行病学调查、PCV2 相关疾病的诊断与研究具有重要意义。
3.3.2 原位杂交技术
原位杂交技术（ISH）是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术。原位杂交（ISH）是利用核酸分子单链之间互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键形成稳定的杂交双链。ISH具有敏感性高和精确定位PCV病毒或PCV及PRRSV病毒DNA或RNA在细胞中的部位的特点。
3.3.3 基因芯片检测技术
基因芯片技术是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新术。姜永厚等在保守序列复制酶基因内设计了两对特异性引物，并在引物之间设计了两种基因型特异的核苷酸探针（22-30mer），建立了基因芯片检测技术。该技术能准确鉴别PCV基因型，其灵敏度是凝胶电泳的5倍，表明寡核苷酸基因芯片技术可有效地应用于PCV感染的临床诊断和分子流行病学调查。肖驰等根据PRRSV、CSFV、PCV2的序列制成相应的探针，并构建DNA芯片。在运用此探针检测20份临床病料发现PRRSV、CSFV 和PCV2 单独感染率分别为0、15% 和5%，PRRSV 与CSFV、PRRSV 与PCV2、PRRSV 与PCV2 和CSFV 混合感染分别为15％、35％和15％。其试验结果表明：DNA芯片检测技术能同时检测出PRRS、CSF 和PCV2 感染，该法具有灵敏度高、特异性强和可重复利用等优点。
4.小结
目前PCV2和其相关的疾病已在全世界范围内发生和流行，给养猪业造成了严重的威胁，引起了国内外学者的广泛关注。因此，建立一种简单、灵敏、经济、实用，适合临床推广的快速检测方法是目前研究的主要任务和方向。虽然目前检测PCV的方法很多，但各种方法都有其自身的局限性，因此要根据试验的目的要求，结合具备的条件选择适宜的检测方法对圆环病毒病进行检测。
（来源：普莱柯生物）
